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質(zhì)粒DNA提取實(shí)驗(yàn)

在我們的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中經(jīng)常會(huì)用到質(zhì)粒DNA，那么具體是怎么來的呢？今天講的是DNA的提取步驟。前提：細(xì)菌繁殖步驟（挑單克隆，置于LB培養(yǎng)基中，置于37℃恒溫?fù)u床搖過夜，180-200rpm）。一般市面上有很多試劑盒可供大家使用，大體步驟都差不多的啦~~我按照我所使用的試劑盒（AxyPrep中抽試劑盒）的步驟分享如下：收集1.50ml離心管收集過夜搖菌的LB培養(yǎng)液（此時(shí)可以做一下判斷，如果液體未變渾濁，說明細(xì)菌并未繁殖成功，這樣肯定難以提出DNA；如果液體渾濁，便說明細(xì)菌繁殖成功啦...

常見問題之蛋白在真核細(xì)胞的表達(dá)量低？

實(shí)際上真核生物的蛋白也可以用真核細(xì)胞蛋白表達(dá)系統(tǒng)來實(shí)現(xiàn)，而且效果往往更好。用原核生物來表達(dá)主要還是因?yàn)椴僮骱唵危焖佟Ｈ绻Ｍ磉_(dá)和純化的蛋白性質(zhì)穩(wěn)定，經(jīng)原核系統(tǒng)表達(dá)之后仍然有正確的折疊構(gòu)象，那么使用原核表達(dá)系統(tǒng)就很合適了。有的時(shí)候在不同的表達(dá)體系里面對(duì)蛋白的表達(dá)量是有影響的。當(dāng)構(gòu)建完成后攜帶有信號(hào)肽的時(shí)候，一些蛋白在真核表達(dá)體系中表達(dá)量極低。去除信號(hào)肽序列值后，直接表達(dá)成熟肽，表達(dá)水平明顯提高。所以說構(gòu)建的真核表達(dá)載體高表達(dá)mRNA卻檢測不到目的蛋白是*有可能的。

常見問題之影響蛋白表達(dá)因素有哪些？

1.蛋白本身的特性：蛋白分子量大小、蛋白來源/物種、是否為毒性蛋白，蛋白翻譯后修飾程度、蛋白自身結(jié)構(gòu)的復(fù)雜程度2.宿主的選擇：宿主本身的特性、蛋白表達(dá)需求等都影響著蛋白表達(dá)3.蛋白需求量：蛋白應(yīng)用范圍對(duì)應(yīng)的需求量不同，所以要根據(jù)需求量確定表達(dá)系統(tǒng)4.質(zhì)粒載體的選擇：載體是攜帶外源基因的工具，要根據(jù)系統(tǒng)選擇合適的載體才能使蛋白更好的表達(dá)5.融合標(biāo)簽的選擇：蛋白重組表達(dá)過程中采用親和標(biāo)簽融合表達(dá)有兩方面的作用：一方面是為了使蛋白純化過程變得更加容易；另一方面是為了促進(jìn)某些不溶性蛋...

常見問題之HIS標(biāo)簽蛋白沒有被洗脫下來

蛋白掛柱后洗脫不下來主要是因?yàn)榈鞍缀椭咏Y(jié)合能力太強(qiáng)或者洗脫條件太溫和，我們可以從以下幾方面考慮解決問題。1、洗脫條件太溫和：重新摸索洗脫條件，增加緩沖液中咪唑濃度或者適當(dāng)降低緩沖液pH以確定最佳的洗脫條件或者更、換緩沖液的成分（換成tris-HCl緩沖液）。2、蛋白在柱子中沉淀：適當(dāng)降低上樣量或蛋白濃度，用咪唑線性洗脫。使用添加劑或者改變NaCl的濃度，或者在變性的條件下洗脫（加4-8M的尿素或者4-6M的鹽酸胍）。3、非特異性的疏水或者其他作用：在洗脫液中加非離子的添加劑...

慢病毒構(gòu)建原理

慢病毒載體（Lentivirus）是一類改造自人免疫缺陷病毒（HIV）的病毒載體，是逆轉(zhuǎn)錄病毒的一種，基因組是RNA，其毒性基因已經(jīng)被剔除并被外源性目的基因所取代，屬于假型病毒。可利用逆轉(zhuǎn)錄酶將外源基因整合到基因組中實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定表達(dá)，具有感染分裂期與非分裂期細(xì)胞的特性。◆慢病毒基因組進(jìn)入細(xì)胞后，在細(xì)胞漿中反轉(zhuǎn)錄為DNA，形成DNA整合前復(fù)合體，進(jìn)入細(xì)胞核后，DNA整合到細(xì)胞基因組中。整合后的DNA轉(zhuǎn)錄成mRNA，回到細(xì)胞漿中，表達(dá)目的蛋白；或產(chǎn)生小RNA。慢病毒介導(dǎo)的基因表達(dá)或小...

帶你學(xué)會(huì)一種藥物研究利器——等溫滴定量熱法

等溫滴定量熱法(IsothermalTitrationCalorimetry,ITC)是近年來發(fā)展起來的一種研究生物熱力學(xué)與生物動(dòng)力學(xué)的重要方法，它通過高靈敏度、高自動(dòng)化的微量量熱儀連續(xù)、準(zhǔn)確地監(jiān)測和記錄一個(gè)變化過程的量熱曲線，原位、在線和無損傷地同時(shí)提供熱力學(xué)和動(dòng)力學(xué)信息。ITC檢測方式與化學(xué)反應(yīng)中的酸堿滴定法相似，在ITC測定中，首先將一種反應(yīng)物置于一個(gè)溫控樣品池中，并通過一個(gè)熱電偶回路與一個(gè)參比池相偶聯(lián)，樣品池和參比池處于相同的外部環(huán)境。特定的滴定劑（按實(shí)驗(yàn)需要選擇）定...

NK細(xì)胞是屬于什么細(xì)胞呢？

NK（自然殺傷細(xì)胞）通過整合識(shí)別MHCI分子的激活和抑制類受體的信號(hào)對(duì)靶點(diǎn)進(jìn)行識(shí)別，對(duì)靶細(xì)胞進(jìn)行直接殺傷，同時(shí)不損傷自身健康細(xì)胞。人體NK細(xì)胞占血液和其他部位中淋巴細(xì)胞的5%-20%，含量豐富，在抗病毒和抗腫瘤免疫中發(fā)揮關(guān)鍵作用。NK是控制急性和慢性病毒感染所必需的，同時(shí)NK能夠促進(jìn)多種腫瘤直接裂解，在不同部位巡邏防止轉(zhuǎn)移。NK細(xì)胞功能的多面性顯示出其在免疫介導(dǎo)的保護(hù)和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)平衡中具有動(dòng)態(tài)作用。根據(jù)CD56和抗體結(jié)合Fc受體CD16的表達(dá)水平，人類NK可細(xì)分為成熟度和功能...

抗痩素納米抗體制備及篩選

瘦素是一種與能量代謝、免疫、生殖等相關(guān)的多功能細(xì)胞因子，其在血液中的含量異常會(huì)導(dǎo)致肥胖、營養(yǎng)不良、心血管疾病、腫瘤、肝病等多種疾病，特別是終末期腎衰患者廣泛存在瘦素水平過高的問題，由此導(dǎo)致腎衰癥患者營養(yǎng)不良、高血壓、胰島素抵抗等并發(fā)癥，這些并發(fā)癥嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量，因此開發(fā)特異性抗體實(shí)現(xiàn)瘦素水平的檢測與去除將具有非常重要的臨床意義。納米抗體由于其諸多優(yōu)良特點(diǎn)，成為該方面研究的選擇。獲得足夠量的抗原是進(jìn)行抗體篩選的前提，由于血液中瘦素含量較低，進(jìn)行了瘦素的制備，然后進(jìn)行抗...