基因載體是基因工程的核心，也是基因治療中強(qiáng)有力的生物工具，我們先來認(rèn)識(shí)和閱讀載體圖譜吧。

一、 載體分類及載體組成元件載體分類1、按屬性分類:病毒載體和非病毒載體病毒載體是一種常見的分子生物學(xué)工具，可將遺傳物質(zhì)帶入細(xì)胞，原理是利用病毒具有傳送其基因組進(jìn)入目的細(xì)胞，進(jìn)行感染的分子機(jī)制。可發(fā)生于完整活體或是細(xì)胞培養(yǎng)中。可應(yīng)用于基礎(chǔ)研究、基因療法或疫苗。用于基因治療和疫苗的病毒載體應(yīng)具備以下基本條件: (1)攜帶外源基因并能包裝成病毒顆粒; (2)介導(dǎo)外源基因的轉(zhuǎn)移和表達(dá); (3)對(duì)，人體不致病;(4)在環(huán)境中不會(huì)引起增殖和傳播。非病毒載體一般是指質(zhì)粒DNA.2、按進(jìn)入受體細(xì)胞的類型分類:原核載體、真核載體、穿梭載體(含原核和真核2個(gè)復(fù)制子，能在原核和真核細(xì)胞中復(fù)制，并可以在真核細(xì)胞中有效表達(dá))。3、按功能分類:克隆載體、表達(dá)載體克隆載體:具有克隆載體的基本元件(Ori， Ampr, MCS 等)，可以攜帶DNApian段或外源基因進(jìn)入受體細(xì)胞并克隆和大量擴(kuò)增DNApian段(外源基因)的載體。

表達(dá)載體:克隆載體中加入一些與表達(dá)調(diào)控(具有轉(zhuǎn)錄/翻譯所必需的DNA順序)有關(guān)的元件即成為表達(dá)載體。載體組成元件1、復(fù)制起始位點(diǎn)Ori:即控制復(fù)制起始的位點(diǎn)。Ori 的箭頭指復(fù)制方向，其他元件標(biāo)注的箭頭多指轉(zhuǎn)錄方向(正向)。2、抗生素抗性基因:可以便于加以檢測，如Amp+，Kan+ (1) Ampr:水解β -內(nèi)酰胺環(huán)，解除氨芐的毒性。(2) tetr :可以阻止四環(huán)素進(jìn)入細(xì)胞。(3) camr:生成氯霉素羥乙酰基衍生物，使之失去毒性。(4) neor (kanr):氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶，使G418(卡那霉素衍生物)失活。(5) hygr: 使潮霉素β失活。3、多克隆位點(diǎn): MCS克隆攜帶外源基因片段，它具有多個(gè)限制酶的單- -切點(diǎn)，便于外源基因的插入。如果在這些位點(diǎn)外有外源基因的插入，會(huì)導(dǎo)致某種標(biāo)志基因的失活，便于篩選。決定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。還要再看外源DNA插入片段大小。質(zhì)粒一-般只能容納小于10kb的外源DNApian段。- -般來說，外源DNApian段越長，越難插入，越不穩(wěn)定，轉(zhuǎn)化效率越低。4、P/E: 啟動(dòng)子/增強(qiáng)子5、Terms:終止信號(hào)6、加poly(A)信號(hào):可以起到穩(wěn)定mRNA作用示例閱讀載體: pENTER載體1)human ORF + pENTE載體2)CMV啟動(dòng)子，T7啟動(dòng)子3)ORF的C端融合了Flag和His tag4) 多克隆位點(diǎn),常用AsisI和MluI(人源基因上不常見的) 4) SV40 poly(A) 加尾信號(hào)5) SV40 啟動(dòng)子啟動(dòng)的puro標(biāo)記6) 2 個(gè)腺病毒ITR序列和2個(gè)與腺病毒Ad5同源的序列，可用于將ORF序列同源重組到腺病毒載體，直接.用于腺病毒的生產(chǎn)。慢病毒載體1) EF1a啟動(dòng)目的基因(可添加小標(biāo)簽FL AG或HIS等小標(biāo)簽) 2) CMV啟動(dòng)GFP,非融合抗性篩選標(biāo)記Puro (便于做細(xì)胞株的穩(wěn)篩) 3) WPRE(來自土撥鼠肝炎病毒的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)元件)，放置在目的基因的上游，能加強(qiáng)轉(zhuǎn)基因的表達(dá)4) cPPT (來自HIV-1整合酶基因)，增加慢病毒在宿主基因組的拷貝數(shù)，提高病毒滴度5)第三代慢病毒載體，載體中還包含HIV-1 基因組中的順式調(diào)節(jié)元件(ψ包裝信號(hào)和LTR長末端重復(fù)序列，其中3’LTR增強(qiáng)子功能缺失，5' LTR中U3區(qū)替代為CMV,更加安全的病毒載體)腺相關(guān)病毒載體AAV表達(dá)載體包括了中兩個(gè)ITR+CMV(可替換其他組織特異性啟動(dòng)子，見改造載體部分) + globin intron內(nèi)含子序列+目的基因+ poly A序列二、選擇和準(zhǔn)備載體選擇載體主要依據(jù)構(gòu)建的目的，同時(shí)還要考慮載體中應(yīng)有合適的限制酶切位點(diǎn)等。如果構(gòu)建的目的是要表達(dá)-一個(gè)特定的基因，則要選擇合適的表達(dá)載體。選用哪種載體，還是要結(jié)合目的基因及載體特點(diǎn)以實(shí)驗(yàn)?zāi)康臑闇?zhǔn)繩。載體選擇主要考慮下述3點(diǎn): 1、構(gòu)建DNA重組體的目的，克隆擴(kuò)增/表達(dá)表達(dá)，選擇合適的克隆載體/表達(dá)載體。2、載體的類型:

(1)克隆載體的克隆能力- -據(jù)克隆片段大小(大選大，小選小)。尤其對(duì)于病毒載體來說，載體包裝容量的大小是評(píng)估能否成功包裝病毒的首要因素。①腺病毒可以插入長約8kb的外源基因。目前，我們包裝過長度為7.5kb外源基因的腺病毒。②慢病毒的包裝容量約為6kb(包含載體帶有的其他抗性基因或報(bào)告基因)，但是2kb以上的外源基因包裝慢病毒難度就增加了，增大1kb會(huì)下降1個(gè)單位數(shù)量級(jí)的滴度，故2kb以上的基因包裝慢病毒需要進(jìn)行評(píng)估。此外，毒性蛋白、調(diào)亡蛋白和膜蛋白(作為受體、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白行使功能)等由于其本身的功能，包裝可能會(huì)有一定難度.③AAV的總包裝容量是4.7 kb( 包含載體中兩個(gè)ITR約0.3kb具體啟動(dòng)子+內(nèi)含子約0.6kb +具體熒光標(biāo)簽+polyA約0.2kb)，所以插入目的基因- -般約2kb左右。由于.AAV包裝容量有限，目的基因大于2kb,可考慮去除內(nèi)含子，因?yàn)閮?nèi)含子只是有助于插入的目的基因穩(wěn)定表達(dá)。

(2)確定表達(dá)蛋白的目的，然后再來選擇優(yōu)勢的表達(dá)質(zhì)粒。- -般分為原核表達(dá)和真核表達(dá)質(zhì)粒，前者主要用于體外純化蛋白，如帶His-tag的PET系列，帶GST-Tag的PGEX系列，選用不同的表達(dá)載體，就得建立相應(yīng)的純化系統(tǒng)，包括緩沖液的配置、珠子/柱子的選擇等等，還得考慮目的蛋白的可溶性，一般大tag的融合蛋白可溶性要好一些，如GST的。這種原核純化的蛋白一般用來制備單一 -的、 需要量大的蛋白。真核表達(dá)載體一般是細(xì)胞、體內(nèi)表達(dá)等需要時(shí)所用，只需要將它放到細(xì)胞或體內(nèi)細(xì)胞即可，weiyi- 考慮的是它的啟動(dòng)子的選擇，常用都是cmv啟動(dòng)子的，表達(dá)效率較高，也有多種啟動(dòng)子經(jīng)過改造的表達(dá)載體，一般用來表達(dá)需要調(diào)控表達(dá)時(shí)間及表達(dá)量的蛋白。

3、載體MCS中的酶切位點(diǎn)數(shù)與組成方向因載體不同而異，適應(yīng)目的基因與載體易于連接，不產(chǎn)生閱讀框架錯(cuò)位。①選分子量小的質(zhì)粒，即小載體(1-1 .5kb)→不易損壞，在細(xì)菌里面拷貝數(shù)也多(也有大載體);②- -般使用松弛型質(zhì)粒在細(xì)菌里擴(kuò)增不受約束，- -般10個(gè)以上的拷貝，而嚴(yán)謹(jǐn)型質(zhì)粒<10個(gè);③必需具備- - 個(gè)以上的酶切位點(diǎn)，有選擇的余地;④必需有易檢測的標(biāo)記，多是抗生素的抗性基因。選擇載體還需注意: 無標(biāo)簽載體，起始/終止密碼子都要添加!標(biāo)簽在N端的載體，終止密碼子要添加!標(biāo)簽在C端的載體，起始密碼子要添加! (詳細(xì)解讀如下)①對(duì)于無起始密碼子和終止密碼子的基因，插入無標(biāo)簽的載體要加入起始密碼子和終止密碼子。②載體N端有標(biāo)簽，上游引物要對(duì)讀碼框;下游 引物要加終止密碼子(為了保證基因的表達(dá),少翻譯載體序列)。鏈接:對(duì)讀碼框是為了防止移碼，是不是移碼要看載體圖譜，看酶切位點(diǎn)。從AtG開始，要保證三個(gè)堿基編碼的氨基酸不能影響插入目的基因的正常編碼，若影響了插入目的基因的正常編碼就要在設(shè)計(jì)引物的時(shí)候在酶切位點(diǎn)前或者后插入一一個(gè)或者兩個(gè)堿基，總之是不能影響插入目的基因的正常編碼蛋白。有的酶切位點(diǎn)含有起始密碼子，如果標(biāo)簽在C端像Nco I就有-一個(gè)ATG，這時(shí)候需要加堿基在酶切位點(diǎn)后面。③載體C端有標(biāo)簽，上游引物要加起始密碼子，且考慮是否加Kozak序列(真核表達(dá)系統(tǒng));下

游引物要對(duì)讀碼框，并且要去掉基因本身的終止密碼子(保證C端標(biāo)簽表達(dá))。鏈接: Kozak序列是位于真核生物mRNA5’端帽子結(jié)構(gòu)后面的一段核酸序列，通常是GCCGCCRCC (常見的序列是GCCACC)，位于起始密碼子(ATG)之前。它可以與翻譯起始因子結(jié)合而介導(dǎo)含有5’帽子結(jié)構(gòu)的mRNA翻譯起始。在真核生物中，該序列相對(duì)比較保守。對(duì)應(yīng)于原核生物的SD序列(原核基因在mRNA5’端起始密碼子AUG上游一段對(duì)mRNA的翻譯起作用的序列)。添加Kozak序列的好處:核糖體需要Kozak序列進(jìn)行穩(wěn)定結(jié)合有助于提高真核基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯的效率。三、改造載體1、改造啟動(dòng)子:一般在過表達(dá)載體中CMV屬于廣譜型的強(qiáng)啟動(dòng)子，具體可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求，選用不同啟動(dòng)子，尤其是對(duì)于AAV載體構(gòu)建時(shí)選用組織特異性啟動(dòng)子。