我們?cè)谶M(jìn)行細(xì)胞實(shí)驗(yàn)時(shí)，或多或少都經(jīng)歷過(guò)細(xì)胞污染的情況，一旦出現(xiàn)細(xì)胞污染的情況，全部細(xì)胞扔掉難免覺(jué)得可惜，之前花的時(shí)間、精力也全部打了水漂。

硬著頭皮接著往下做，做出的結(jié)果也缺乏說(shuō)服力，還可能使污染情況更加嚴(yán)重。

細(xì)胞污染情況復(fù)雜，通常認(rèn)為的細(xì)胞污染都是微生物污染。但是凡混入細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境中對(duì)細(xì)胞生存有害的成分和造成細(xì)胞不純的異物都應(yīng)視為污染。

細(xì)胞污染不能*被消除，但能減少其發(fā)生的頻率和后果的嚴(yán)重性。細(xì)胞污染根據(jù)污染源主要可以分為物理性，化學(xué)性和生物性污染。

一、物理性污染的來(lái)源、危害及預(yù)防

物理性污染常常被人們所忽視或被籠統(tǒng)地歸為化學(xué)性污染。物理性污染通過(guò)影響細(xì)胞培養(yǎng)體系中的生化成分，從而影響細(xì)胞的代謝。培養(yǎng)環(huán)境中的物理因素，如溫度、放射線、振動(dòng)、輻射(紫外線或熒光)會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生影響。

細(xì)胞、培養(yǎng)液或其它培養(yǎng)試劑暴露于放射線、輻射或過(guò)冷過(guò)熱的溫度中，可以引起細(xì)胞代謝發(fā)生改變，如細(xì)胞同步化、細(xì)胞生長(zhǎng)受抑制甚至細(xì)胞死亡。

細(xì)胞培養(yǎng)箱應(yīng)放在溫度較恒定的環(huán)境中，周圍不能放置能引起機(jī)械振動(dòng)的設(shè)備，如離心機(jī)等。培養(yǎng)液從冰箱中取出后應(yīng)在室溫中放置一段時(shí)間后再進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以避免過(guò)冷的溫度對(duì)細(xì)胞的影響。

二、化學(xué)性污染的來(lái)源、危害及預(yù)防

培養(yǎng)環(huán)境中許多化學(xué)物質(zhì)都可以引起細(xì)胞的污染。化學(xué)物質(zhì)并不總是抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)，某些化學(xué)物質(zhì)如激素就可促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)。不同細(xì)胞對(duì)化學(xué)物質(zhì)污染的反應(yīng)是不一樣的。

未純化的物質(zhì)、試劑、水、血清、生長(zhǎng)輔助因子及儲(chǔ)存試劑的容器都可能成為化學(xué)性污染的來(lái)源。細(xì)胞培養(yǎng)的必需養(yǎng)分若濃度超過(guò)了合適的范圍，也會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性。

同樣，不同細(xì)胞系其最佳培養(yǎng)條件下對(duì)血清和緩沖液的要求是不一樣的，在培養(yǎng)中應(yīng)嚴(yán)格控制。

動(dòng)物血清是細(xì)胞培養(yǎng)中常用的天然培養(yǎng)基，但血清又是潛在的生物及化學(xué)污染的來(lái)源。由于血清采集于多個(gè)動(dòng)物，而且不同廠商的生產(chǎn)工藝及質(zhì)量各不相同，因此血清中許多成分的濃度存在很大的變異。

血清對(duì)不同細(xì)胞的促生長(zhǎng)能力及毒副作用取決于這些細(xì)胞的分化功能、組織來(lái)源及培養(yǎng)基的成分等因素。在進(jìn)行一系列實(shí)驗(yàn)時(shí)，為了保證實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性，最好選用同一批次的血清。

培養(yǎng)液、培養(yǎng)附加成分、試劑培養(yǎng)液、培養(yǎng)附加成分、試劑都可能成為化學(xué)性污染的來(lái)源。

三、微生物污染

由于體外培養(yǎng)的細(xì)胞自身沒(méi)有抵抗污染的能力，而在培養(yǎng)基中加抗生素的抗污染能力也是有限的，因而細(xì)胞微生物污染一旦發(fā)生往往是無(wú)法挽救的。

一般在細(xì)胞受到污染早期或污染較輕時(shí)，能及時(shí)處理并除去污染物，部分細(xì)胞還有可能得到挽救。但當(dāng)細(xì)胞持續(xù)在污染環(huán)境中生長(zhǎng)時(shí)，輕者細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢；較重的細(xì)胞增殖停止，細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)大量堆積物，細(xì)胞變圓或崩解，從瓶壁脫落。

不同的微生物污染物對(duì)細(xì)胞的影響也有差別，微生物中支原體和病毒對(duì)細(xì)胞形態(tài)和技能的影響是長(zhǎng)期的，緩慢的和潛在的。而霉菌和細(xì)菌增殖迅速，能在很短的時(shí)間內(nèi)抑制細(xì)胞生長(zhǎng)或產(chǎn)生有毒物質(zhì)殺滅細(xì)胞。

芽孢桿菌、葡萄球菌是細(xì)菌污染的主要菌屬，污染的主要特征為培養(yǎng)基變黃、渾濁，低倍鏡下呈沙粒狀布滿細(xì)胞間隙或培養(yǎng)基，高倍鏡下可見桿狀或球狀的細(xì)菌在培養(yǎng)基中游動(dòng)。

常見的真菌污染是白色念珠菌污染，污染后培養(yǎng)基無(wú)明顯渾濁和變色，鏡下可見排列成串珠狀的球形真菌，污染嚴(yán)重時(shí)可見念珠菌連成片狀或團(tuán)狀。真菌的運(yùn)動(dòng)能力較弱，鏡下一般看不到運(yùn)動(dòng)。

霉菌污染時(shí)培養(yǎng)基一般也不變渾濁，顏色變化也不明顯，但肉眼可見漂浮的白色菌落，顯微鏡下可看到樹枝狀的菌絲。

支原體在鏡下無(wú)法看到，因而支原體污染時(shí)只能看到細(xì)胞狀態(tài)明顯變差卻沒(méi)有其他微生物污染的跡象，此時(shí)可通過(guò)PCR檢測(cè)確定。

還有一種被稱之為“黑膠蟲"的污染，在顯微鏡下觀察呈一粒一粒小黑點(diǎn)，成布朗運(yùn)動(dòng)，會(huì)阻礙細(xì)胞正常生長(zhǎng)，對(duì)于這個(gè)說(shuō)法眾說(shuō)紛紜，有人說(shuō)其就是細(xì)胞碎片（并不是它影響了細(xì)胞狀態(tài)，而是細(xì)胞狀態(tài)發(fā)生變化出現(xiàn)了黑膠蟲增多）；有人說(shuō)這是玻璃培養(yǎng)瓶中的硅顆粒；有人認(rèn)為這是支原體污染（可穿過(guò)濾膜，可空氣傳播）；有認(rèn)為是真菌污染的；也有說(shuō)是寄生類原蟲污染的……

但也沒(méi)有一個(gè)明確的研究能夠證實(shí)這種情況，眾多的研究只是在驗(yàn)證這些猜想，現(xiàn)在也沒(méi)有一個(gè)明確的說(shuō)法。

那么

如何急救呢？

01

判斷污染源

一旦發(fā)現(xiàn)細(xì)胞有污染的跡象或已污染，需要立即對(duì)污染源進(jìn)行判斷：有無(wú)操作不當(dāng)？培養(yǎng)基、胰酶、PBS等顏色、澄清度是否正常？

02

及時(shí)處理

若確定現(xiàn)有的培養(yǎng)基、胰酶、PBS可用，則繼續(xù)使用；若無(wú)法確定則新配*培養(yǎng)基、PBS、胰酶，原有的液體在確定是否污染后再做處理。

以貼壁細(xì)胞為例

對(duì)細(xì)菌污染細(xì)胞進(jìn)行急救：

1

立即棄去培養(yǎng)容器內(nèi)的培養(yǎng)基，以PBS潤(rùn)洗2~3次，加入胰酶處理至細(xì)胞形態(tài)略有改變但未脫離容器時(shí)棄去胰酶，加入PBS輕輕潤(rùn)洗1遍；

2

加入20×雙抗，浸泡細(xì)胞3~5min，棄去雙抗；

3

加入新鮮的*培養(yǎng)基（含10×雙抗）培養(yǎng)12h；

4

12h棄去培養(yǎng)基以PBS潤(rùn)洗2~3遍后加入*培養(yǎng)基（含10×雙抗）；

5

傳代時(shí)以較小轉(zhuǎn)速離心（如平時(shí)以1000r/min離心，則可降為800~900r/min離心），仍以含10×雙抗的培養(yǎng)基培養(yǎng)；

6

若第二代后鏡下找不到細(xì)菌，則第三代起可正常培養(yǎng)。正常培養(yǎng)48h后無(wú)反彈則可認(rèn)為污染已清除。

若為霉菌污染，在以PBS潤(rùn)洗2~3遍后換液，無(wú)需加入高濃度雙抗。培養(yǎng)48h后污染未再次出現(xiàn)即可。

若為真菌污染，在PBS潤(rùn)洗、換液后可加入兩性霉素B（兩性霉素B有細(xì)胞毒性，不推薦使用），也可加入300μg/mL氟康唑培養(yǎng)，污染控制后改用150μg/mL培養(yǎng)2~3代。

若懷疑支原體污染，則可進(jìn)行PCR檢測(cè)或直接使用支原體清除試劑。也可購(gòu)買環(huán)丙沙星注射液，于超凈臺(tái)內(nèi)打開直接添加到培養(yǎng)基中，以20μg/mL濃度2代后改用10μg/mL濃度持續(xù)培養(yǎng)約2周。

當(dāng)然，*解的方案還是復(fù)蘇更換新的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。最后祝愿大家都能培養(yǎng)健康正常的細(xì)胞